isolasi dan pemurnian senyawa flavonoid

isolasi dan pemurnian senyawa flavonoid

Senyawa  flavonoid merupakan senyawa  yang tidak tahan panas, selain itu senyawa flavonoid mudah teroksidasi pada suhu yang tinggi.

Isolasi flavonoid umumnya dilakukan dengan metode ekstraksi, yakni dengan cara maserasi atau sokletasi menggunakan pelarut yang dapat melarutkan flavonoid. Flavonoid pada umumnya larut dalam pelarut polar, kecuali flavonoid bebas seperti isoflavon, flavon, flavanon,dan flavonol termetoksilasi lebih mudah larut dalam pelarut semipolar. Oleh karena itu pada proses ekstraksinya, untuk tujuan skrining maupun isolasi, umumnya menggunakan pelarut methanol atauetanol. Hal ini disebabkan karena pelarut ini bersifat melarutkan senyawa–senyawa mulai dari yang kurang polar sampai dengan polar. Ekstrak methanol atau etanol yang kental, selanjutnya dipisahkan kandungan senyawanya dengan tekhnik fraksinasi, yang biasanya berdasarkan kenaikan polaritas pelarut (Monache, 1996).

            Senyawa flavonoid diisolasi dengan tekhnik maserasi,mempergunakan pelarut methanol teknis. Ekstraksi methanol kental kemudian dilarutkan dalam air. Ekstrak methanol–air kemudian difraksinasi dengan n-heksan dan etil asetat. Masing–masing fraksiyang diperoleh diuapkan, kemudian diuji flavonoid. Untuk mendeteksi adanya flavonoid dalam tiap fraksi, dilakukan dengan melarutkansejumlah kecil ekstrak kental setiap fraksi kedalam etanol.Selanjutnya ditambahkan pereaksi flavonoid seperti : natrium hidroksida, asam sulfat pekat, bubuk magnesium–asam klorida pekat,atau natrium amalgam–asam klorida pekat. Uji positif flavonoid ditandai dengan berbagai perubahan warna yang khas setiap jenis flavonoid (Geissman, 1962). 

Metode yang biasa digunakan dalam mengisolasi senyawa flavonoid adalah dengan mengekstrak jaringan segar dengan metanol. Terhadap bahan yang telah dihaluskan, ekstraksi dilakukan dalam dua tahap. Pertama dengan metanol:air (9:1) dilanjutkan dengan metanol:air (1:1) lalu dibiarkan 6-12 jam. Penyaringan dengan corong buchner, lalu kedua ekstrak disatukan dan diuapkan hingga 1/3 volume mula-muIa, atau sampai semua metanol menguap dengan ekstraksi menggunakan pelarut heksan atau kloroform (daIam corong pisah) dapat dibebaskan dari senyawa yang kepolarannya rendah, seperti lemak, terpen, klorofil, santifil.

Cara lain yang dapat dipakai untuk pemisahan adalah ekstraksi cair-cair, kromatografi kolom, kromatografi lapis tipis dan kromatografi kertas. Isolasi dan pemurnian dapat dilakukan dengan kromatografi lapis tipis atau kromatografi kertas preparatif dengan pengembangan yang dapat memisahkan komponen paling baik (Harborne, 1987). Flavonoid (terutama glikosida) mudah mengalami degradasi enzimatik ketika dikoleksi dalam bentuk segar. Oleh karena itu disarankan koleksi yang dikeringkan atau dibekukan. Ekstraksi menggunakan solven yang sesuai dengan tipe flavonoid yg dikehendaki. Polaritas menjadi pertimbangan utama. Flavonoid kurang polar (seperti isoflavones, flavanones, flavones termetilasi, dan flavonol) terekstraksi dengan chloroform, dichloromethane, diethyl ether, atau ethyl acetate, sedangkan flavonoid glycosides dan aglikon yang lebih polar terekstraksi dengan alcohols atau campuran alcohol air. Glikosida meningkatkan kelarutan ke air dan alkohol-air. Flavonoid dapat dideteksi dengan berbagai pereaksi, antara lain:

a.       Sitroborat

b.      AlCl₃

c.       NH₃

Sebelum melakukan suatu isolasi senyawa, maka yang dilakukan adalah ekstraksi terlebih dahulu.

Ada beberapa jenis isolasi pada flavonoid, di antaranya sebagai berikut :

1. Isolasi Dengan Charaux Paris

Serbuk tanaman diekstraksi dengan metanol,lalu diuapkan sampai kental dan ekstrak kental ditambah air panas dalam volume yang sama, Ekstrak air encer lalu ditambah eter, lakukan ekstraksi kocok, pisahkan fase eter lalu uapkan sampai kering yang kemungkinan didapat bentuk bebas. Fase air dari hasil pemisahan ditambah lagi pelarut etil. asetat diuapkan sampai kering yang kemungkinan didapat Flavonoid O Glikosida. Fase air ditambah lagi pelarut n - butanol, setelah dilakukan ekstraksi, lakukan pemisahan dari kedua fase tersebut. Fase n-butanol diuapkan maka akan didapatkan ekstrak n - butanol yang kering, mengandung flavonoid dalam bentuk C-glikosida dan leukoantosianin. Dari ketiga fase yang didapat itu langsung dilakukan pemisahan dari komponen yang ada dalam setiap fasenya dengan mempergunakan kromatografi koLom. Metode ini sangat baik dipakai dalam mengisolasi flavonoid dalam tanaman karena dapat dilakukan pemisahan flavonoid berdasarkan sifat kepolarannya.

 

2. Isolasi dengan beberapa pelarut.

Serbuk kering diekstraksi dengan kloroform dan etanol, kemudian ekstrak yang diperoleh dipekatkan dibawah tekanan rendah. Ekstrak etanol pekat dilarutkan dalam air lalu diekstraksi gojog dengan dietil eter dan n-butanol, sehingga dengan demikian didapat tiga fraksi yaitu fraksi kloroform, butanol dan dietil eter.

Permasalaha:

Pada artikel diatas dijelaskan bahwa pada isolasi yang dilakukan dengan beberapa pelarut, pertama serbuk kering diekstraksi dengan menggunakan kloroform dan etanol kemudian ekstrak dipekatkan dibawah tekanan rendah. Jadi yang ingin saya Tanyakan begini kenapa ekstrak harus dipekatkan dibawah tekanan yang renadah?? Apa pengaruhnya terhadap senyawa yang akan dihasilkan???

 

penentuan struktur terpenoid

Keterkaitan antara biosintesis, metode isolasi, dan penentuan stuktur senyawa bahan alam sangatlah erat. Dapat dikatakan ketiga proses tersebut terjadi secara berurutan. Suatu senyawa bahan alam terlebih dahulu di sintesis agar diketahui proses/ reaksi kimia yang terjadi dalam memperoleh senyawa kimia yang diinginkan. Setelah itu diisolasi dengan metode tertentu agar dapat dipisahkan dari senyawa lain yang terkandung di dalamnya. Dengan melakukan isolasi suatu senyawa, maka kita dapat menentukan struktur dari senyawa tersebut.

 

Penentuan struktur terutama dilakukan dengan metoda spektroskopik
·           Spektroskopi IR
Spektrofotometri inframerah  digunakan untuk identifikasi suatu senyawa melalui gugus fungsinya. Untuk keperluan elusidasi struktur, daerah dengan bilangan gelombang 1400 – 4000 cm^-1 yang berada dibagian kiri spektrum IR, merupakan daerah yang khusus berguna untuk identifikasi gugus-gugus fungsional, yang merupakan absorbsi dari vibrasi ulur. Selanjutnya daerah yang berada disebelah kanan bilangan  gelombang 1400 cm^-1 sering kali sangat rumit karena pada daerah ini terjadi absorbsi dari vibrasi ulur dan vibrasi tekuk, namun setiap senyawa organik memiliki absorbsi yang kharakteristik pada daerah ini. Oleh karena itu bagian spektrum  ini disebut daerah sidikjari (fingerprint region). Saat ini ada dua macam instrumen yaitu spektroskopi IR dan FTIR (Furier Transformation Infra Red). FTIR lebih sensitif dan akurat misalkan dapat membedakan bentuk cis dan trans, ikatan rangkap terkonyugasi dan terisolasi dan lain-lain yang dalam spektrofotometer IR tidak dapat dibedakan.
·           Spektroskopi UV
spektroskopi ultra violet memiliki kemampuan untuk mengukur jumlah ikatan rangkap atau konyugasi aromatik didalam suatu molekul. Daerah panjang gelombang dari spektrum ultra violet berkisar 200 - 400 nm. Penyerapan sinar ultra violet oleh suatu molekul akan menghasilkan transisi diantara tingkat energi elektronik molekul tersebut. Transisi tersebut terjadi pada orbital ikatan atau pasangan elektron bebas dengan orbital anti ikatan.


·           Spektroskpi NMR
Spektroskopi NMR memberikan gambaran mengenai atom-atom hidrogen dalam sebuah molekul. Spektroskopi NMR merupakan suatu metode Spektroskopi yang didasarkan pada penyerapan gelombang radio oleh inti-inti dalam molekul organik bila berada dalam medan magnet yang kuat.


·           Spektroskopi massa
Spektometer massa adalah suatu instrumen yang dapat menyeleksi molekul-molekul gas bermuatan berdasarkan massa atau beratnya. Teknik ini tidak dapat dilakukan dengan spektroskopi, akan tetapi nama spektroskopi dipilih disebabkan persamaannya dengan pencatat fotografi dan spektrum garis optik. Umumnya spektrum massa diperoleh dengan mengubah senyawa suatu sampel menjadi ion-ion yang bergerak cepat yang dipisahkan berdasarkan perbandingan massa terhadap muatan. Proses ionisasi menghasilkan partikel-partikel bermuatan positif, dimana massa terdistribusi adalah spesifik terhadap senyawa induk. Selain untuk penentuan stuktur molekul, spektum massa dipakai untuk penentuan analisis kuantitatif.

Misalnya salah satu percobaan didapat data sebagai berikut:

    Penentuan Sruktur Senyawa

-          Analisis Spektrum IR

Pada fraksi C2-1, spectrum IR yang dihasilkan menunjukkan adanya pita serapan gugus fungsi OH pada bilang gelombang 3423,4 cm^-1 ; vibrasi ulur C-H sp³ pada bilangan gelombang 2933,5 cm^-1 dan 2852,5 cm^-1 ; C=C pada bilangan gelombang 1627,9 cm^-1 ; vibrasi tekuk CH₃ pada bilangan gelombang 1449,4 cm^-1. Bilangan gelombang tersebut menunjukkan bahwa senyawa pada fraksi C2^-1 merupakan senyawa alifatik.

Pada fraksi C11-2, spectrum IR yang dihasilkan menunjukkan adanya pita serapan gugus fungsi OH pada bilang gelombang 3433,1 cm^-1 ; vibrasi ulur C-H sp³ pada bilangan gelombang 2922,0 cm^-1 dan 2852,5 cm^-1 ; C=C pada bilangan gelombang 1627,8 cm^-1 ; vibrasi tekuk CH₃ pada bilangan gelombang 1382,9 cm^-1 ; C-O pada bilangan gelombang 1041,5 cm^-1. Bilangan gelombang tersebut menunjukkan bahwa senyawa pada fraksi C11-2 merupakan senyawa alifatik dan tidak terglukasi karena tidak menunjukkan adanya pelebaran puncak OH yang menandakan senyawa yang terglukasi.

Dari hasil pengukuran IR pada kedua fraksi, dapat diduga kedua fraksi terdapat senyawa yang sama, berdasarkan spectrum pada kedua senyawa terdapat gugus-gugus yang sama dengan hal ini menunjukkan kedua fraksi memiliki pola kromatogram yang mirip.

-          Analisis Spektrum NMR

Analisis spectrum NMR ¹H

Analisis spectrum NMR ¹H terhadap fraksi  C11-2 dan C2-1 dilakukan untuk mengetahui gambaran berbagai jenis atom hydrogen dalam molekul. Spectrum NMR ¹H senyawa dari fraksi C2-1 dan C11-2 memperlihatkan pada geseran 0,51-2,27 ppm merupakan sinyal untuk H yang terikat dengan karbon sp³. Pada geseran sekitar 3,34 ppm merupakan sinyal untuk H yang terikat dengan C heteroatom atau lebih spesifik dengan C metoksil (C-O). dan pada geseran 4,63-5,15 ppm merupakan sinyal untuk H yang terikat dengan C ikatan rangkap. Dari spectrum ini dapat disimpulkan bahwa senyawa yang berhasil di isolasi merupakan senyawa alifatik dengan ikatan rangkap, memilki ikatan heteroatom, dan tidak memilkii gugus karbonil.

Analisis Spektrum NMR ¹³C

Analisis spectrum NMR ¹³C dimaksudkan untuk menentukan kerangka karbon yang dimilki oleh senyawa. Pada spectrum ini dapat diketahui jumlah karbon dan jenis karbonnya (metal, metilen, metin, atau karbon quartener).

Spectrum NMR ¹³C Decopling

Spectrum ini menunjukkan seluruh karbon yang terdapat di senyawa dengan menghilangkan pengaruh atom tetangga (decopling) akan tetapi pada spectrum ini tidaka ada pembeda untuk jenis karbonnya. Pada pengukuran NMR ¹³C terlihat geseran spectrum dimulai dari geseran 11,8-147,70. Perhitungan jumlah karbon berdasarkan analisis spekrum ini didapat jumlah karbon senyawa pada fraksi C2-1 adalah 30.[1][4]

---